技术参数与实验流程
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技术参数

样本要求	测序策略	数据要求
• 样品类型： DNA • 样品需求量：总量>15μg；浓度≥100ng/μL • 样品质量：260/280介于1.7-2.0之间 • 样本无明显降解	• Hiseq 2×150	• 一般建议测序基因组大小的30×数据量

经典文章解读
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案例1:多样本全基因组甲基化测序揭示基因启动子区和基因主体区甲基化在转录调控中的相互补充作用

背景：启动子区DNA甲基化参与转录调控，但甲基化的程度和表达抑制程度的关系仍不明确；此外，启动子区和基因主体区的甲基化功能相关性也不明确。

方法：Trio家系三个样本外周血单核白细胞提取RNA和DNA，分别进行转录组测序和全基因组甲基化测序。

结果：

• •        3例样本总体甲基化模式差别不大。
• •        基因表达和甲基化程度呈现明显的L形状模式。即极端高表达的基因甲基化程度很低，反之亦然。但是，对于绝大多数基因来说，甲基化程度和基因表达关联性并不高（Pearson correlation = −0.0486, Spearman correlation = 0.0709）。将甲基化区域拆分成启动子区，基因本体区，或者是外显子区、内含子区，都没有观察到显著的关联差异。这些提示我们，DNA甲基化程度与基因表达高低不是简单的线性相关关系。
• •        基于统计模型的构建，提示总体来看DNA甲基化是基因表达水平的指标，但基因本体甲基化程度比启动子区甲基化程度的指标作用更佳。
• •        统计分析发现，启动子区或者外显子区甲基化存在很少的冗余，即任一区域的甲基化已经足够引起低表达。
• •        研究发现，整合组蛋白修饰数据和甲基化数据后，模型的统计效力进一步提升，提示组蛋白修饰和甲基化修饰都不能完全决定对基因表达的调控。

参考文献：Lou, S., et al., Whole-genome bisulfite sequencing of multiple individuals reveals complementary roles of promoter and gene body methylation in transcriptional regulation. Genome Biol, 2014. 15(7): p. 408.


案例2：番茄果实发育的单碱基分辨率甲基化谱揭示与成熟相关的表观修饰

背景：番茄果实的成熟是由植物激素乙烯引发，但它的影响受一个未知的发育线索所限制，为了确定这个未知的发育线索是否涉及表观遗传重塑，本研究对番茄用甲基转移酶抑制剂处理，结果发现果实提前成熟。通过对对果实发育中从不成熟到完全成熟的4个阶段番茄果实进行全基因组甲基化测序，数据表明，表观基因组在果实发育过程中不能是静态的，可能已被选择用于确保发育过程的保真度。

方法： 研究人员对果实发育中从不成熟到完全成熟的4个阶段番茄果实（17d，39d，42d，52d），2个成熟缺陷变异株 (Cnr和rin变异) 的成熟期果实和1个野生型番茄叶片进行全基因组甲基化测序，测序深度为10×。

结果：

• •        覆盖了基因组90%的C位点，构建了其表观基因组图谱，并揭示其组织和发育时期的甲基化差异。
• •         通过sliding-window的方法扫描4个发育时期的差异甲基化区域 (DMR)，共发现52,095个差异甲基化区域 (DMR)。
• •         通过ChIP-seq分析直接调控果实成熟基因的转录因子RIN， 结果发现RIN的结合位点主要位于调控成熟基因的启动子的去甲基化区域，大多位于差异甲基化区域 (DMR)附近，并且这种结合伴随去甲基化发生。

参考文献： Zhang S., et al., Single-base resolution methylomes of tomato fruit development reveal epigenome modifications associated with ripening. Nature biotechnology, 2013 Feb;31(2):154-9.