miRNA测序_上海天昊生物科技有限公司|上海天昊遗传分析中心

miRNA测序
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技术简介：
miRNA (microRNA) 是一种大小约21-23个碱基的单链小RNA，miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达。基于Illumina HiSeq高通量测序技术的miRNA-seq，可以一次获得数百万条miRNA序列，能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的miRNA及其表达差异，为研究miRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。

应用领域：

• 快速鉴定不同物种、不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的microRNA及其表达差异
• microRNA编辑、microRNA异构体检测、新microRNA预测及microRNA靶基因分析

技术优势：

• 通量高：一次测序得到500万条以上的序列；
• 分辨率高：可以检测小 RNA单个碱基的差异；
• 精准度高：从几个到数十万个拷贝精确计数；
• 不依赖已知信息：既能鉴定已知miRNA，又能发现新miRNA；
• 可重复性高：深度测序保证了抽样随机性，重复性非常好，无需重复实验。

技术参数与实验流程
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技术参数

样本要求	文库类型	测序策略
Total RNA，总量>2ug，浓度≥200 ng/μL； RNA无明显降解 (28S:18S>1.8；RIN>7)	Small RNA文库	Hiseq SE50；单个样本6-10M clean reads

实验流程

数据分析流程

经典案例解读
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【肿瘤】MiRNA测序解析存在治疗响应差异的不同亚型弥漫大B细胞淋巴瘤miRNA组学差异

研究背景：

弥漫性大B细胞淋巴瘤 (Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL) 是一类侵袭性疾病，是最常见的成人非霍奇金恶性淋巴瘤(NHL)，根据其不同的细胞来源和对化疗的响应的不同可以分为活化B细胞样 (ABC) 和生发中心B细胞样(GCB)两种亚型，其中ABC亚型的病人(30~40%)在现有的初期治疗中失败。

研究目的：

为研究DLBCL的miRNAome，从miRNA水平开发新的生物标记和治疗目标，对NHL的临床管理有重要作用。

研究方法：

• 92 例DLBCL患者(30 ABC-DLBCL, 41 GCB-DLBCL, 和21 unclassified-DLBCL ) 和15例早期中心母细胞淋巴瘤的新鲜冰冻样品进行miRNA-seq，筛选差异miRNA和发现新miRNA。
• 140 例独立的DLBCL 甲醛固定、石蜡包埋(FFPET)组织样本的miRNA-seq数据验证生存分析。
• 新miRNA的qPCR验证和候选miRNA双荧光素酶验证。

研究结果：

图1 表达谱聚类分析图

1. miRNA-seq在92例DLBCL 和15例中心母细胞样本中发现310个已知miRNA。同时鉴定了234个候选的novel miRNAs，其中30个高表达miRNA进行后续分析，表达图谱见图1b，同时在7,266个TCGA的miRNA-seq 样品库中分析这些miRNA的表达量，发现3个miRNAs (NOVELM00260M, NOVELM00010M和miR-10398-3p) 在B细胞显著富集。

2. 差异分析结果中63个miRNA在DLBCL中高表达，39个低表达，同时也利用TCGA的数据集分析了B细胞和其它癌症中差异表达的miRNA。另外，也分析了可以区分不同亚型DLBCL的差异miRNA，其中23个在ABC-DLBCL亚型中高表达，30个在GCB-DLBCL亚型中高表达。

图2 DLBCL中候选miRNA:mRNA的相互作用

3. 同时测定这些样本的mRNA表达谱，找到候选的miRNA:mRNA调控互作，并进行GO分析，结果发现与在DLBCL中高表达miRNA相互作用的mRNA主要富集在cell cycle, metabolic processes, chromatin modification, protein modification, nerve growth factor signaling pathway和organelle organizaion相关的通路中(图2)。

图3. NMF分析鉴定两类DLBCL 患者有着不同的miRNA表达和 outcome特征.

4. 分析这些miRNA与癌症患者的总生存期和无进展生存期的关系，发现58个和45个miRNA分别与OS和PFS相关，进一步进行Cox比例风险多变量分析，确定25个miRNA独立于IPI和COO与OS、PFS相关。同样在FFPET 组织活检的验证组样本中验证了部分在发现组发现的一些相关miRNA
5. 为进一步确定DLBCL患者是否可以通过其miRNA的表达量进行分层，通过无监督的非负矩阵分解(NMF)共识聚类对83例R-CHOP处理患者的miRNA表达量进行分析，可以鉴定出两类患者 (图3)，他们有着不同的outcome相关性和miRNA表达谱。