RRBS_上海天昊生物科技有限公司|上海天昊遗传分析中心

RRBS
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技术简介：
RRBS测序（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切富集启动子及CpG岛区域，并进行Bisulfite测序，同时实现DNA甲基化状态检测的高分辨率和测序数据的高利用率。DNA甲基化研究一直是疾病研究的热点，与基因表达、表型性状息息相关。RRBS作为一种高性价比的甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

技术优势：

• 可以确定甲基化位点，减少数据量，通量较高,单碱基分辨率
• 准确性高：数字化信号，直接测定每个转录本片段的序列

应用领域：

• 基因表达调控
• 发育表观组学
• 进化表观组学

技术参数与实验流程
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技术参数

样本要求	文库类型	测序策略	数据要求
样本类型：基因组DNA 样品需求量：总量≥5 μg；浓度≥50ng/μL 样品纯度：OD260/280 =1.8~2.0。样本无明显降解，无蛋白、RNA污染	200bp 插入片段文库	Hiseq 2×150	单个样本数据量大于5G，在总数据中对于酶切片段目标区域平均测序深度>30X，CpG区域覆盖比例>40%。

实验流程

数据分析流程

经典案例解读
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【肿瘤】RRBS测序揭示急性早幼粒细胞白血病的基因组甲基化水平变化，提示甲基化阻断了转录因子与基因组的结合

研究背景：

肿瘤发生往往伴有DNA甲基化模式异常。特定的甲基化模式往往和特定的DNA突变相对应。急性早幼粒细胞白血病（APL）疾病进程中甲基化变化一直没有明确的研究结果。

研究样本：

18例初次诊断患者（对照：8例复发患者密度离心富集骨髓细胞；4例健康患者的CD34+细胞； 4例健康患者的CD34+细胞体外转化的前骨髓细胞），PML—RARα转基因小鼠/野生型小鼠骨髓细胞；逆转录病毒转导造血母细胞不同时间点的样品。

研究平台：

RRBS；Illumina methylation bead array 450K芯片。

研究结果：

1. 原始甲基化水平数据可以将样本聚类为2类： APL患者为一类，复发患者与其它样品为一类。同时，RRBS的结果和甲基化芯片结果具有很好的相关性（图一）。
2. 和健康对照相比，APL患者基因组整体甲基化水平主要为中度甲基化（20%-80%），少部分为低甲基化。高甲基化比例和健康对照相差不大。因此，APL患者整体甲基化水平偏高，但染色体末端甲基化程度降低（图二）。
3. PML-RARalfa结合位点并不一定是甲基化水平差异位点，提示PML-RARalfa的结合保护了结合位点被过度甲基化（图三）。
4. 小鼠和细胞实验提示，白血病发病和表型的晚期事件和甲基化变化存在紧密关联。

图一：基于甲基化水平测序原始数据聚类图显示样品的聚类情况。

图二：相比于健康对照，APL患者基因组越靠近末端的地方，甲基化水平越低。

图三：APL患者相比于健康对照，PML-RARalfa结合位点甲基化程度偏低。

研究结论

• APL疾病发生伴有DNA高甲基化和整体甲基化水平变异增加，同时染色体末端区域存在甲基化水平降低。APL疾病中，部分基因组因为DNA甲基化免于被促癌转录因子的结合，如PML-RARalfa。PML-RARalfa引发白血病发生与甲基化水平改变事件是相互独立的。

• 参考文献：Schoofs T, Rohde C, Hebestreit K, et al. DNA methylation changes are a late event in acute promyelocytic leukemia and coincide with loss of transcription factor binding.[J]. Blood, 2013, 121(1):178-87.