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全基因组甲基化测序

全基因组甲基化测序技术介绍
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技术简介:
       
全基因组重亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite Sequencing)是基于重亚硫酸盐的甲基化分析方法,首先通过重亚硫酸盐对样本DNA进行处理,将未甲基化的C碱基转化为U碱基,而甲基化的C碱基则不会改变,进行PCR扩增后U碱基会变成T,与原本甲基化的C碱基区分开,再结合高通量测序技术,可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。

应用领域:
  •         •  基因表达调控
  •         •  发育表观组学
  •         •  进化表观组学
技术优势:
  •         •  可精确分析每一个C碱基的甲基化状态
  •         •  可在全基因组水平上最大限度的获取完整的甲基化信息,精确绘制全基因组甲基化图谱
  •         •  适用于所有具有参考基因组的物种
  •         •  性价比高,相对于传统BSP或MSP方法,费用少
技术参数与实验流程
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技术参数
样本要求 测序策略 数据要求
  • 样品类型: DNA
  • 样品需求量:总量>15μg;浓度≥100ng/μL
  • 样品质量:260/280介于1.7-2.0之间
  • 样本无明显降解
Hiseq 2×150
  • 一般建议测序基因组大小的30×数据量

 

实验流程

A.    建库测序流程


B.     数据分析流程

经典文章解读
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案例:早期发育的玉米种子胚与胚乳的差异转录网络


背景:番茄果实的成熟是由植物激素乙烯引发,但它的影响受一个未知的发育线索所限制,为了确定这个未知的发育线索是否涉及表观遗传重塑,本研究对番茄用甲基转移酶抑制剂处理,结果发现果实提前成熟。通过对对果实发育中从不成熟到完全成熟的4个阶段番茄果实进行全基因组甲基化测序,数据表明,表观基因组在果实发育过程中不能是静态的,可能已被选择用于确保发育过程的保真度。

方法: 研究人员对果实发育中从不成熟到完全成熟的4个阶段番茄果实(17d,39d,42d,52d),2个成熟缺陷变异株 (Cnr和rin变异) 的成熟期果实和1个野生型番茄叶片进行全基因组甲基化测序,测序深度为10×。

结果:
  •         • 覆盖了基因组90%的C位点,构建了其表观基因组图谱,并揭示其组织和发育时期的甲基化差异。
  •         •  通过sliding-window的方法扫描4个发育时期的差异甲基化区域 (DMR),共发现52,095个差异甲基化区域 (DMR)。
  •         •  通过ChIP-seq分析直接调控果实成熟基因的转录因子RIN, 结果发现RIN的结合位点主要位于调控成熟基因的启动子的去甲基化区域,大多位于差异甲基化区域 (DMR)附近,并且这种结合伴随去甲基化发生。


参考文献: Zhang S., et al., Single-base resolution methylomes of tomato fruit development reveal epigenome modifications associated with ripening. Nature biotechnology, 2013 Feb;31(2):154-9.

图一: 番茄的表观基因组图谱

图二:不同组织、发育时期的甲基化差异
图三: RIN结合位点区域特征

 
 
 
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