|
扩增子测序技术介绍
***************************************************************************************************** 技术简介： 扩增子测序就是通过对基因组目的区域进行PCR扩增，将目标区域DNA扩增富集后进行高通量测序的研究策略。目前扩增子测序服务主要包括细菌16SrDNA区/真菌ITS1区/真菌ITS2区/真菌18SrDNA区测序以及后续的数据分析工作，可有效研究特定环境中的物种信息，包括：物种差异、物种分类、物种丰度，对复杂环境中的微生物构成研究有重要的指导作用。 16S rDNA测序 : 16SrRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16SrDNA就是编码该亚基的基因，存在于所有细菌基因组。16S rDNA大小适中，约1.5Kb左右，同时具有高度的保守性和特异性。16S rDNA既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，目前已被广泛用于病原菌的检测和鉴定。 18S rDNA测序 : 18S rDNA为编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列。在结构上分为保守区和高变区，保守区反映生物物种间的亲缘关系，高变区反映物种间的差异。 ITS 测序: 在真核生物中，18S rDNA和28S rDNA转录间隔序列称为ITS区。ITS分为两个区域：ITS1/ITS2，ITS1位于18S和5.8S之间，ITS2位于5.8S和28S之间。ITS由于是非转录区，承受的选择压力较小，变异强，目前已广泛用于真菌分类鉴定。 功能基因测序: 功能微生物是在自然界中由于其功能的重要性而受到广泛关注的一类微生物，如硝化细菌、反硝化菌、氨氧化细菌、硫酸盐还原菌、固氮菌、固氮菌等。每种功能微生物在分类学上可能有很大不同，但却具有相类似的基因使其能够发挥同样的功能，因此使这些功能细菌发挥这种特定功能的基因就称为功能基因，如nxrA、nirS/nirK、amoA、dsrB、nifH、nifH。功能基因测序就是针对这些功能基因设计PCR通用引物，进行建库高通量测序。 应用领域:
技术优势
技术参数与实验流程
***************************************************************************************************** 技术参数
实验流程：
经典文章解读
***************************************************************************************************** 案例1：人类，动物对南极无冰土壤地区微生物群落结构的影响 背景：南极具有世界上最极端的环境，这些极端环境只支持相对简单的生态系统，因此南极生态系统对外部干扰（如气候变暖或人活动）特别敏感。土壤微生物群落是土壤养分循环系统的主要驱动因素，它特别容易受到无冰地区的外部干扰，例如企鹅、海豹。随着最近几十年气候的变暖，冰川融化，出现了新的无冰地区，因此企鹅、海豹数量增多，同时人类在无冰地区的活动也会对生态系统造成影响，这些活动都会改变土壤微生物群落结构，因此很需要了解人类，动物对南极无冰地区土壤微生物群落结构的影响。 方法：为了解人类，动物对南极无冰土壤地区微生物群落的影响，对南极洲菲尔德斯地区的4种不同土壤样品（人类、企鹅、海豹影响土壤和原始土壤）进行针对16S rRNA rRNA V3高变区的扩增子测序。 结果：4种土壤样品的地球化学性质和细菌群落结构存在显著差异，在这些样品中分别鉴定出数量不同的OUTs（3503 to 4536）；细菌多样性由多到少分别是企鹅影响土壤、原始土壤、人类影响土壤、海豹影响土壤。 变形菌，放线菌，酸杆菌，疣微菌存在于所有这4种土壤样品。在变形菌中丰度最高的是Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria，在放线菌中丰度最高的是放线菌亚纲。 基于距离的冗余分析显示，PH值、磷、有机碳、有机氮是与土壤细菌群落分布的最重要的相关因素。 OTU聚类分析显示，12个土壤样品被分为4组，对应于4种土壤类型。 维恩图显示4种土壤类型中细菌的OUT有所差异，例如地点特异的OUT数目变化很大，从海豹影响土壤（3685）到人类影响土壤（5589），只有927个细菌OUT是这四种类型土壤所共有的。 对土壤中50个主要OTUs进行热图和网络图分析，结果表明占据主导地位的50个OTUs在四种类型土壤中的丰度不同并且在每种类型土壤中占据主导地位的OTU也不同。 参考文献：Wang NF et al. Diversity and structure of soil bacterial communities in the Fildes Region (maritime Antarctica) as revealed by 454 pyrosequencing[J]. Front. Microbiol, 2015, 6:1188. 
图一：(A）南极洲菲尔德斯地区4个样品采集地区；(B）受人类群体影响的地点（W2）；（C）受海豹影响的地点（36）；（D）受企鹅群体影响的地点（Q11）；（E）原始土壤地点（A1）。
图二：12个土壤样品中细菌群落基于OTU的聚类分析
图三：.维恩图显示在4种土壤类型中细菌OTU重叠的程度（在3%的进化距离）
图四：（A）4种类型土壤50个主要的OTUs的heatmap图；（B）4种类型土壤50个主要的OTUs的网状图
案例2：人类孕期微生物群落多样性或提示早产风险因素背景：早产发生在怀孕37周之前，是新生儿死亡的重要原因之一，它折磨着全世界11%的孕妇。20%的早产发生与羊膜腔内细菌定植有关，而母亲的自身微生物群落是最有可能的羊膜腔内细菌定植来源。美国斯坦福大学David Relman及其同事提出，怀孕阶段的微生物群组成可能提示早产风险因素。 方法：研究者采取纵向案例对照研究，选取了49名18岁及以上的孕妇（其中15名孕妇发生早产），对孕妇每一周以及产后的阴道、大便、唾液和牙齿/牙龈的微生物群落进行了采样。 结果：通过焦磷酸测序和illumina测序平台对微生物DNA16S rDNA扩增子测序，结果发现在整个怀孕期间4种组织来源微生物群组成和多样性大致保持稳定；多数女性在分娩之后发生微生物群组急剧而持久的变化，主要表现在乳酸杆菌水平降低以及多种厌氧菌的出现；阴道微生物群落分析表明存在5个主要微生物群落组成，其中4个群落都以乳酸杆菌为优势物种，且为不同的乳酸杆菌类型。第5个群落类型缺乏乳酸杆菌，但是菌种多样性很丰富；对于某些阴道微生群缺乏乳酸杆菌的女性，加德纳菌和脲原体的丰富程度与早产有关联。以上结果提示，怀孕早期阶段的微生物群落多样性可能为早产风险提供线索，并且可能影响产后母亲和婴儿的健康。 参考文献：Digiulio D B, Callahan B J, Mcmurdie P J, et al. Temporal and spatial variation of the human microbiota during pregnancy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015, 112. 
图一：怀孕期间4种组织来源微生物群组成和多样性大致保持稳定
图二：40例孕期女性阴道微生物纵向多样性分析获得5个主要微生物群落组成(CST)。1，2，3，5这四个群落都以乳酸杆菌为优势物种，且为不同的乳酸杆菌类型。CST 4群落类型缺乏乳酸杆菌，但是菌种多样性很丰富.
图三：（A）CST 4群落微生物多样性丰度程度与早产呈正相关；（B）CST4样本所属孕妇在任一孕期发生早产的比例都是最高的。
|
