胎儿染色体数目异常是引起自发性流产的最重要原因，主要发生机制是配子减数分裂过程中随机性的发生染色体不分离。此外，若父母本身存在染色体的平衡易位，其后代则会有几率遗传到异位染色体而造成复发性流产。临床染色体检测的方法很多，如核型分析，基因芯片等，但复杂的实验操作和昂贵的价格使得这些技术在当前无法广泛应用。

        近期，发表在Prenatal Diagnosis的一篇论文让介绍了一种新的方法（CNVplex®）用于基因组全部24条染色体（22条常染色体和2条性染色体）的倍性检测，揭示自发性流产是否由染色体异常引起。同时，这种方法可以检测到染色体末端重复，提示父母一方或双方可能存在染色体平衡易位，因此需要进行核型分析，及时采取措施预防流产的再次发生。在检测准确性上，CNVPlex®与基因芯片一致，但成本却是后者的十分之一。

        天昊研发团队已经将这种技术转化为适用于临床的染色体非整倍检测试剂盒，方便快捷的对流产原因进行排查，减轻孕妇心理负担，提供遗传学信息从而辅助临床医生提出合适的指导方案。天昊同时提供对流产组织样本以及母亲基因组DNA进行个体鉴定(STR分析)，排除可能的母系污染，大大加强了结果的可信度。

        至今为止天昊诊断也已持续研发多种临床筛查和诊断的产品，从孕前，产前到新生儿覆盖整个生育过程。其中包括孕前夫妇遗传病携带者筛查，男性不育相关基因检测，新无创TM产前胎儿唐氏综合征筛查，遗传性耳聋90项检测，新生儿遗传病筛查，以及高发单项遗传病检测项目（如地贫，DMD，成骨不全，X脆性综合征等）。天昊诊断一直致力于创新基因检测科技，实现科研向临床的转化，以更好的防治出生缺陷，守护人类健康。

        下面小编带大家回顾这篇研究，了解CNVplex®在其中的表现。


A copy number variation genotyping method for aneuploidy detection in spontaneous abortion specimens


一种用于散发性流产产物的染色体非整倍体筛查方法


Prenatal Diagnosis


3.043


上海交大医学院，国际和平妇幼保健院


CNVplex®和aCGH


        研究者在24条染色体的的着丝粒两侧以及端粒附近设计探针，平均每条染色体覆盖5-8对，共计170对（探针分布如下图： 其中1-12号染色体，16和17号染色体有8对探针；18-20号染色体，X染色体上各有7对探针；13-15号染色体，21-22号染色体及Y染色体上各有5对探针），用以检测每条染色体靶定区域的拷贝数情况。因此CNVplex®不仅可检测24条染色体的数目异常，对于染色体的末端缺失或重复的情况也可以进行检测。


        染色体的异常，如染色体非整倍体已被证明是引起自发性流产的最主要原因，但对于流产的遗传学原因的分析，临床上并没有广泛开展。对流产物进行染色体非整倍体的检测有助于揭示流产的病理。在这项研究中，我们使用一种高通量连接探针扩增法（High-throughput Ligation-dependent Probe Amplification ,HLPA）商业名CNVplex®，检测流产物中24条染色体的倍性信息，并验证此方法在其中的表现（有效性及准确性）。



        首先，研究者对23个正常DNA样本进行拷贝数的检测，得到了正常样本（拷贝数为2）的拷贝数值分布。下图（Figure 2）为23个正常对照样本的拷贝数结果（分布在24条染色体的170个探针上），可见拷贝数的范围落在1.6-2.4之间（虚线）。所有对照样本的拷贝数平均值为1.990 (s.d. = 0.131) 。根据所得结果研究者定义其值大于2.5为目标区段的拷贝增加，低于1.5为拷贝缺失。具体为数值在 2.5-3.5提示检测样本为三体，0.5-1.5 提示为单体，对于嵌合体(样本中部分细胞正常，部分为非整倍体的现象), 研究者通过三个连续探针拷贝数在2.3-2.5之间或者在1.3-1.5之间为标准，提示样本可能为三体嵌合或者单体嵌合。为了确诊待测样本是嵌合体还是母系污染，需进行FISH检测或者STR分析。考虑到操作简便，且成本较低，研究者选择了STR分析对母亲和胎儿的DNA进行鉴定以排除母血污染。

Figure 2. 23个正常对照样本在170个探针位置相应拷贝数值

注：盒型图代表23个样本在此位置的拷贝数中位数以及阈值范围，Y染色体的拷贝数结果只统计了男性样本


        本研究通过HLPA和aCGH分别检测98例自然流产组织中染色体拷贝数情况，并对两种方法的结果进行了比较，发现中HLPA方法检测得到的结果与aCGH完全一致，其中Figure 3A展示了其中一例样本，aCGH和HLPA都清晰的显示胎儿为2号染色体三体。

        98例样本中49例被检测到为染色体非整倍体，我们对染色体变异的类型进行了统计：包括2号染色体三体异常3个，3号染色体三体异常1个，6号染色体三体异常1个，8号染色体三体异常1个，9号染色体三体异常1个，10号染色体三体异常1个，11号染色体三体异常1个，12号染色体三体异常1个，13号染色体三体异常1个，14号染色体三体异常1个，15号染色体三体异常2个，16号染色体三体异常15个，19号染色体三体异常1个，10号染色体三体异常2个，21号染色体三体异常3个，22号染色体三体异常2个，X单体异常9个。16号三体为本研究检测到最多的染色体数目异常(30.6%)，这与之前的研究是一致的。

        对样本7120177（编号）而言，aCGH显示其在2号染色体上Cy5/Cy3 荧光比例上升，但并不显著 (Figure 3B). 相同的, HLPA检测结果显示靶定在2号染色体的8个探针拷贝数的平均值仅为2.51(分别为2.35, 2.62, 2.66, 2.40, 2.45, 2.47, 2.72 和 2.40)，其中3 个连续探针拷贝数在2.3-2.5之间。这些结果提示样本7120177 可能为嵌合体。

Figure 3.待测样本 7120158 (A)和7120177 (B) 分别运用aCGH和HLPA得到的拷贝数结果

注：X轴代表各染色体（chr1-chr22，X,Y）,aCGH中Y轴的值为 log2(Cy5/Cy3)  (待测样本与正常男性样本的荧光比值). 数值超过绿色的线或者低于红色的线分别代表待测样本为三体或者单体。在HLPA检测中，Y轴代表所计算出的拷贝数数值，黄线之间的为正常样本拷贝数（2）的范围
(B) 待测样本7120177, aCGH检测结果显示2号染色体荧光信号有轻微上调，HLPA检测结果显示2号染色体拷贝数平均值为2.51，均提示该样本为嵌合体或被污染。
 

        对待测样本7120177进行了Short tandem repeat (STR) 鉴定 , 以确认是样本本身是嵌合体或外源DNA污染导致。结果见表1。研究者发现此样本在所有STR位点只显示2个等位基因，因此样本并没有被外源DNA污染，从而确定其为2号染色体三体的嵌合体。

表1：样本7120177  STR 检测结果

 

        染色体核型分析是诊断染色体异常最经典的方法，它可以检出染色体数目异常以及大于4Mb的染色体结构异常，但需要活细胞培养，操作繁琐，且费时（约10天左右）；其他的技术如SNP芯片，aCGH，NGS法等，性价比都不高，也不适用于普遍快速筛查，而像FISH，MLPA等技术的限制性在于其通量不高，与这些技术相比，HLPA（CNVplex®）延续了MLPA的特点，特异性强，检测波动小（<10%）。


        染色体核型分析是诊断染色体异常最经典的方法，它可以检出染色体数目异常以及大于4Mb的染色体结构异常，但需要活细胞培养，操作繁琐，且费时（约10天左右）；其他的技术如SNP芯片，aCGH，NGS法等，性价比都不高，也不适用于普遍快速筛查，而像FISH，MLPA等技术的限制性在于其通量不高，与这些技术相比，HLPA（CNVplex®）延续了MLPA的特点，特异性强，检测波动小（<10%）。


        这一体系通过参照位点检测拷贝数，所以不适合检测多倍体，这与MLPA、aCGH是一样的；文章中使用的探针组分辨率有限，不能检测染色体微缺失微重复或者平衡易位的情况。此外，这一技术本身无法排除外源DNA的污染，所以需要使用STR分析排除可能的母血污染（尤其当核型为46，XX时）。但是，CNVplex®本身的高准确性以及低成本，使得它非常适用于自发性流产的临床普筛。

        天昊诊断自创立之初坚持以技术创新作为公司发展核心动力，基于目前国际流行的基因检测平台开发了多项创新技术，其中包括AccuCopy®多重基因拷贝数检测技术，CNVPlex®高通量基因拷贝数检测技术，iMLDR®多重SNP及突变分析技术，SNPscan®高通量SNP及突变分析技术，EasyTarget®多重基因片段快速富集技术， SNPseq®超高通量SNP及突变分析技术，CNVseq®超高通量基因拷贝数检测技术等具有国际水平的专利技术，希望通过自主研发的创新技术促进国内基础医学遗传研究以及人类各种疑难疾病的致病机理的探索，同时利用这些技术开发适合临床应用的各类基因检测产品，服务于我国人民大众的健康事业，同时还致力于科研相关试剂的研制与开发工作。因此，公司始终将"创新基因科技，守护人类健康"作为公司长期发展的核心理念。