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题目：Carbon constrains fungal endophyte assemblages along the timberline (沿着树带界线碳约束的内生真菌群落 )
期刊名： Environmental microbiology 发表时间：2015.7 IF：5.932 单位：南京中国科学院土壤科学研究所 技术：真菌ITS1区扩增子测序 测序平台：454 FLX测序平台
材料：研究者主要采集位于中国东北地区吉林省长白山斜坡上的岳桦树树叶，采集海拔梯度从1700-2100米的6个采样地，每个采样地选取9个树木样本，每个数目样本采集20片叶片（共1080片，6 Sites * 9 Trees * 20 Leaves）
采集方法：叶片是从每个海拔梯度中随机选取的每棵当年生树木枝干的中间部分采集；样本树的枝干约高地面1.5m-4.5m（从海拔2076和1630m到1847和1921m）；树木的枝干一般朝向北部，东南和西南方向；均匀采样以减少样本之间的差异性。
分析方法：QIIME计算alpha多样性，SPSS比较多样性指数差异，回归曲线和pearson相关性，NMDS分析beta多样性，Cytoscape绘制网络图以及R中vegan软件包进行差异性分析（Adonis/ANOSIM）
研究背景:
植物体内普遍存在着内生菌，主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌三大类。树木和灌木叶片内的内生真菌代表了一类广泛存在并且高多样性的真菌类群。目前高通量扩增子测序为研究陆地植物组织真菌多样性提供了便利条件。成百上千个叶片真菌物种仅仅在一个植物中被发现，成千上万个叶片真菌物种在其生长本土范围内的单一植物种上被发现。然而，但是关于它们沿着环境梯度的多样性模式仍然是不清楚的，另外关于这些复杂的内生真菌群落在相同的宿主种中怎么进行组合的了解也少之又少。
岳桦树（Betula ermanii）是一种落叶阔叶物种，广泛分布在陡峭的斜坡上或者北方的森林中，大多位于日本，俄罗斯偏东地区和中国的东北地区。研究者采集不同海拔梯度的树木样本叶片进行ITS1区高通量测序，同时对叶片组织的C组成及含量和其它的物理特征进行测量，从而用来比较不同海拔梯度叶片内生真菌群落的alpha和Beta多样性，以及不同环境因子对群落组成和分布的影响，并找出驱动群落变异的主要环境因素，这些群落多样性和组成变异可以用来反馈或者影响森林生态系统中的碳循环和动态过程。
实验设计及分析流程图：
研究结果：
一 数据特征
研究者总共采集了54个岳桦树样本（1080片叶片），对ITS1区测序分析共生真菌细菌群落，共得到1079386条序列，每个样本序列范围在795-81697条之间，形成了1762个OTU。研究者未去除Singletons(487条，27.64%)，因为它们可能代表了一些稀有的微生物类群。此外，通过去除掉singletons得到的一些的主要结果也并没有影响观察到的趋势。
与一些已有的叶片内生真菌的研究结果相一致，所观测到的OTU丰富度的稀释性曲线未能接近于渐近线（Fig S1）。这可能表明了由于采样或者序列深度问题一些稀有的内生真菌物种没有被观测出。尽管如此，岳桦树或者采样地点的丰富度是可以比较的。
Fig. S1 所观测到的OTU丰富度的稀释性曲线
岳桦树内生真菌群落中子囊菌占据主导地位，占总序列的82.73%。此外，非双核的内生真菌（74条序列）类群也被发现（Table S1）。在1762个OTU中，15个主要的内生真菌OTUs通过NCBI被比对出，这些序列占据了所有序列的84.57%（Table S2）。许多假定存在的一些真菌类群也在先前植物研究中发现，支持了它们潜在的共生能力。
Table S1沿海拔梯度岳桦树的内生真菌门总结
（包括序列数目；每个分类序列数目占总序列数目的百分比；每个分类单元OTUs的数目）
Table S2基于比对NCBI得到中国长白山岳桦树的15个最高丰度OTUs
二 沿海拔梯度多样性和群落组成差异
研究者发现种系丰富度随着海拔高度逐渐递增（R2 = 0.1774，P = 0.0069），而均匀度仅仅在高海拔位点增加（R2 =0.6859，P < 0.0001；Fig 1）。香农多样性指数也随海拔逐渐增加（R2 = 0.3733，P < 0.0001）。NMDS图显示内生真菌群落随海拔高度在逐渐变化（Fig.2A）。ANOSIM分析结果显示不同海拔高度的内生真菌群落有着显著性差异（Table S3）。特别的，随着海拔梯度升高，担子菌门相对丰度显著升高（Fig.3A）。
Fig. 2. 基于计算54个树样本×OTU矩阵得到的NMDS图。每一个点（n = 54）表示单个树样本的内生真菌群落。海拔梯度被制成光滑的表面，以适应NMDS排序。
Table S3沿海拔梯度变化内生真菌组成的差异分析
 
Fig. 3. 门水平的分类组成
观测到的242个区分明显的真菌属，只有62个在所有的海拔梯度中被发现（Fig 4）。这些共有的位点属类群作为假定存在的主要属类群，超过所有序列的98%。此外，在每个海拔梯度上也有特异的一些属类群，尤其在2076m海拔处，特异属类群在242个区分明显真菌属中占11.98%。因此，在不同海拔梯度中的内生真菌群落组成差异可以由主要内生真菌物种的相对丰度差异和稀有物种的出现或消失来说明。
Fig. 4. OTU网络图显示属水平上来自不同海拔的所有样品OUT之间的相互作用。每一个点代表一个真菌属（共有242属）。在左栏中的属对于一个海拔地点是唯一的，而右栏中的属隶属于多个海拔地点。
三 沿海拔梯度植物特征的变化
几乎所测量植物的一半，包括树木特征，叶片中基本化学元素成分和叶片碳组分在不同海拔梯度采样点显著变化，其中一些表现出明显的划分趋势。岳桦树树高，直径，树荫长度和宽度和相邻树木密度随海拔显示出一个单峰趋势（Fig S3）。10个基础元素中，只有C，和Fe含量随海拔高度变化有显著性变化。此外，沿海拔梯度变化的四个碳组分含量有显著性差异（Fig S4） 。木质素含量随海拔高度增加显著降低，而半纤维素随海拔升高缓慢增加，纤维素在高海拔位点含量显著增加，而可溶性糖类表示出相反趋势。
Fig. S2 5个测量的树特征和海拔高度之间的关系
Fig. S3叶中的10个基本元素和海拔高度之间的关系
Fig. S4四个叶中的碳组分和海拔高度之间的关系
四 环境因子对内生真菌多样和群落组成差异的影响
研究者发现海拔梯度与内生真菌多样性和群落组成显著相关，以及一些与海拔梯度差有关的一些植物特征变化。这些植物特征或许对所观测到的Alpha和Beta多样性有着一定影响。Pearson相关性分析表明，除了海拔梯度，树木大小，树叶化学元素和树叶碳组分可能在不同程度上显著影响着内生真菌的alpha多样性。有趣的是发现叶片碳组分和内生真菌alpha多样性指数之间有着强正相关作用，比海拔梯度对均匀度和香农多样性指数相关性更强。在四个碳组分中，纤维素和总碳含量对内生真菌alpha多样性有着相似的作用。尽管当控制海拔梯度因子，物种丰度度和任何测量的植物特征属性没有显著相关性。
此外，Mantel检验发现（基于Canberra距离）内生真菌的群落组成和环境因子变异之间显著相关（pearson相关系数从高到低排列）：海拔梯度>碳含量>相邻树木生长密度>木质素>纤维素>Fe含量>树高>树荫宽度>树径。通过R中的vegan软件包中的bioenv功能，筛选出一系列显著相关环境因子，包括海拔梯度，碳含量，树高，纤维素，木质素和C/N比（Fig 2B）。当控制海波梯度，我们发现叶片碳含量持续显著影响着内生真菌群落组成（r = 0.119, P = 0.01）。此外，树高和树荫宽度与内生真菌群落显著相关，但是解释贡献度值在边缘（r<0.077）。因此，尽管去除掉海拔梯度的影响，在所有的测量指标中叶片碳含量被认为是对内生真菌alpha和Beta多样性影响最为显著的因素（Fig 5）。
Fig. 2B. 基于计算54个树样本×OTU矩阵得到的NMDS图。通过R中的vegan软件包中的bioenv功能，筛选出与整个菌落最相关的6个环境因子
Fig. 5.叶片碳含量对岳桦树叶片内生真菌alpha和Beta多样性影响。左侧：α多样性指数（丰富度和均匀度）；右侧：叶片碳含量NMDS分析
总体评价：
1研究者采用454测序平台成本高，样本测序深度低，建议使用Miseq测序平台，可获得更多的序列和节约成本；
2 研究结果中使用了不同的距离算法进行群落聚类，可考虑使用相同的距离进行比较更加合理。
关于天昊：
天昊生物采用Miseq PE250测序策略对细菌16S rDNA区/真菌ITS区/真菌18S rDNA区的双V区或多种单V区进行测序，使用低循环数扩增，保证每个样品扩增的循环数统一；采用特殊方法可有效避免系统内误差；数据质量高，有效序列Q30达到80%以上；加上最新升级的分析内容和解释详尽的结题报告，带您享受极致的微生物扩增子测序体验。
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