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单菌基因组测序服务:准确、高效就在天昊!

  1. 1.    服务介绍
       细菌/真菌广泛存在于大自然中,其具有多样性丰富,基因组较小等特征。其中细菌是一类只存在拟核的裸露DNA的单细胞原核生物(基因组大小一般小于10Mb),它包括真细菌古生菌两大类群,根据其基本形态可分为球菌,杆菌,螺旋菌,根据细胞壁组成成分,又分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,大多数化脓性细菌属于革兰氏阳性菌,它们能产生外毒素使人致病;而大多数肠道菌则属于革兰氏阴性菌,它们能产生内毒素使人致病。常见的革兰氏阳性菌有葡萄球菌,链球菌,肺炎双球菌,破伤风杆菌等;常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌,伤寒杆菌,大肠杆菌,变形杆菌等。 细菌对人类既有用处又有危害,一方面细菌是某些疾病的病原体,可导致伤寒、肺炎等疾病,另一方面,人类也常利用细菌制作乳酪及酸奶等。真菌则是一种低等真核生物(基因组大小约为2.5 Mb-100Mb),复杂度介于细菌和动植物之间,最常见的真菌是各类蕈类,霉菌和酵母。真菌门可分为担子菌亚门,子囊菌亚门,半知菌亚门等,其中担子菌亚门包含许多具有食用和药用价值的有益真菌,如银耳金针菇灵芝等,半知菌亚门则包含许多对农作物和森林致病的病原菌,如稻瘟病菌。
       随着高通量测序技术的迅速发展,测序成本大幅降低使得获得具有简单基因组的细菌/真菌基因组信息更加便捷,获得某个细菌/真菌基因组信息,不但可以帮助了解其表型特征,致病机制以及其重要相关基因的功能,还可以通过和其它细菌/真菌基因组信息进行比对分析和进化分析,从而了解其分子进化机制。根据不同的研究目的和需求,细菌/真菌基因组测序又包括细菌/真菌de novo测序(框架图、精细图、完成图和细菌/真菌重测序,进一步可以细分为如下5个产品:
       细菌/真菌框架图:采用小片段建库,HiSeq深度测序和初步的基因组组装策略,性价比高,满足细菌/真菌基因组研究基本需求。
       细菌/真菌精细图:采用大片段加小片段建库,二代加三代测序和反复优化的基因组联合组装策略,是目前研究细菌/真菌基因组的主流技术。
       细菌完成图:综合利用一代二代甚至三代测序技术,根据菌株具体情况制定最优策略,最终得到一条完整的基因组序列(1 Contig,0 gaps),是细菌基因组测序组装的最高要求。
       真菌完成图:综合利用二代、三代测序技术,以及光学图谱 (OM) 技术,根据菌株具体情况制定最优策略,最终得到真菌的完成图 (scaffold_num = chr_num),是真菌基因组测序组装的最新要求。
       细菌/真菌重测序:针对已知基因组序列的细菌/真菌,采用小片段建库,HiSeq深度测序,后续分析不依赖于组装,关注基因组变异情况(包括SNP和InDel等),是群体研究的首选。
  1. 2.    技术优势
  1.        A.    测序方案灵活:根据待测菌株定制最优策略,综合利用一代二代三代测序技术
  2.        B.    分析团队强大:拥有强大的生物信息团队,分析内容全面,并提供个性化分析
  3.        C.    实验体系严格:从DNA抽提,质检到文库构建,上机测序有严格的实验流程
 
  1. 3.    技术参数
  1. 4.    服务流程
  1.        A.    建库测序流程
  1.        B.    数据分析流程
  1. 5.    经典文章解读
案例1:肠球菌Enterococcus faecium TX16的全基因组测序及比较分析

背景:在欧美国家,肠球菌是医院获得性感染(hospital-acquired infections)的主要原因,其中Enterococcus faecalisEnterococcus faecium是导致肠球菌感染的两种最常见菌株。过去十年中,由E. faecium菌株引起肠球菌感染的比例不断上升。虽然在医院环境中E. faecium逐渐取代E. faecalis的机制并不清楚,但许多基因型鉴定和系统生物学研究已经指出了多种E. faecium菌株在全球临床环境中的广泛传播。然而,E. faecium完整基因组的缺失成为系统研究E. faecium分子流行病学和发病机制的主要障碍。

方法:在本研究中,首次对E. faecium菌株TX16(隶属于ST18家族)进行了全基因组测序。随后将TX16的全基因组与21个E. faecium菌株基因组草图(未完全测通)进行了比对,通过系统生物学,多位点序列分析和基因相似性分析,并对ORFs、多种基因和信号通路进行了分析。

结果:
  1.        1)    获得了E. faecium菌株TX16 的全基因组图谱,TX16基因组包含2,703个编码蛋白的ORFs、62个tRNA、6拷贝的核糖体rRNA 和32个非编码RNA。
  2.        2)   通过系统生物学,多位点序列分析和基因相似性分析,找到了医院相关菌株(HA)(hospital-associated strains,包含STs16、STs17、STs18、STs78家族),成功将HA菌株与非医院来源的CA菌株(community-associated)区分开来,HA菌株和CA菌株的核心基因组平均有3-4%的核苷酸序列差异。
  3.        3)   菌株TX16的378个ORFs在HA菌株中特异存在。大部份是转座子相关基因、转运蛋白基因、噬菌体基因。
  4.        4)   TX16基因组中找到9个与致病性相关的基因组岛(GIs)。
  5.        5)   耐抗生素基因在HA菌株中大量富集。
  6.        6)   移动因子(如IS16和转座子)也几乎是HA菌株独有的。

图1:肠球菌Enterococcus faecium TX16的全基因组圈图。TX16基因组含有2,698,137 bp,包含2,703个编码蛋白的ORFs、62个tRNA、6拷贝的核糖体rRNA 和32个非编码RNA。
图2:22个E. faecium菌株的直接同源基因分析。分析发现2,543个基因只在某一个菌株中存在,22个菌株共有1,652个基因(1,608个单拷贝,44个多拷贝)。
 
 
图3:22个E. faecium菌株的核心基因和全部基因数量。 (A) E. faecium核心基因数量,最后汇聚到1,726个基因;(B) E. faecium全部基因数量,共包含6,262个基因。
 
图4:22个E. faecium菌株的进化树。成功的将HA菌株与CA菌株区分开来。
 
图5:22个E. faecium菌株基因组ORFs的比较。
参考文献:Xiang Qin, et al. Complete genome sequence of Enterococcus faecium strain TX16 and comparative genomic analysis of Enterococcus faecium genomes. BMC Microbiology 2012, 12:135.

案例2:全基因组重测序揭示肌球蛋白-5的突变引起禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗性

背景:小麦赤霉病是由禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)引起的一种重要病害,该病给小麦的产量造成严重损失。氰烯菌酯是一种新型杀菌剂,它能强烈抑制禾谷镰孢菌,但禾谷镰孢菌在选择压下易对氰烯菌酯产生抗性。因此了解禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗性机制就变得很重要,这将有助于对小麦赤霉病进行有效控制。

方法:为了探明禾谷镰孢菌对杀菌剂氰烯菌酯产生抗性的机制,以禾谷镰刀菌标准株PH-1作为参考,对抗氰烯菌酯菌株YP-1进行重测序(115×,99.35%  coverage),通过和PH-1序列进行比对,发现抗氰烯菌酯菌株YP-1的突变基因,然后针对这些突变基因在更多的抗性菌株中进行目标测序,从而确定影响氰烯菌酯抗性的位点,接着通过抗性实验确定导致对氰烯菌酯产生抗性的具体功能位点。

结果:
  1.        1)    通过和标准株PH-1序列进行比对,发现含有1989个SNP的抗氰烯菌酯菌株YP-1在132个基因上有氨基酸突变。
  2.        2)   在这132个发生氨基酸突变的基因中只有22个基因是在禾谷镰孢菌数据库中已知的。然后对氰烯菌酯敏感菌株2021和6个抗性菌株YP-1、Y2021A、B、C、D和F的这22个基因进行测序,结果只有肌球蛋白-5在所有抗性菌株中有点突变(肌球蛋白-5基因序列的216、217、418、420和786位点核苷酸发生改变)。
  3.        3)   为了证实肌球蛋白-5基因点突变是否真的引起对氰烯菌酯抗性,在抗性菌株YP-1,氰烯菌酯敏感菌株2021通过同源双交换技术交换肌球蛋白-5基因,结果发现导入一个拷贝抗性片段就能引起对氰烯菌酯抗性,导入一个拷贝感性片段就能引起对氰烯菌酯感性。
  4.        4)   氰烯菌酯抗性实验证明216、217、418和420位点突变能导致禾谷镰孢菌对氰烯菌酯产生抗性,而786位点突变则不能导致禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗性。

 

表1:禾谷镰刀菌抗氰烯菌酯菌株YP-1的全基因组测序数据统计(通过和标准株PH-1序列进行比对)
 
表2:在野生型2021和相关突变体中肌球蛋白-5核苷酸序列的改变(216、217、418、420和786位点核苷酸发生改变)

 
 
图1.氰烯菌酯抗性菌株在肌球蛋白-5基因216、217、418、420和786位点发生突变
 
 
图2. 通过同源双交换技术构建肌球蛋白-5基因重组突变体并进行验证
 
 
图3 . 禾谷镰刀菌株的菌落形态。(A) 氰烯菌酯(JS399-19)对敏感菌株(2021),抗性菌株(Y2021A、B、C、D和F),以及肌球蛋白-5基因点突变菌株生长的影响。(B)  2021,PH-1 和所有突变体的菌落形态。
 
参考文献: Zheng ZT, et al. Whole-genome sequencing reveals that mutationsinmyosin-5 confer resistanceto the fungicide phenamacril in Fusarium graminearum. Scientific Reports 2015, 5: 8248.
 
 
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