单菌基因组测序服务：准确、高效就在天昊!_上海天昊生物科技有限公司|上海天昊遗传分析中心

1. 服务介绍

       细菌/真菌广泛存在于大自然中，其具有多样性丰富，基因组较小等特征。其中细菌是一类只存在拟核的裸露DNA的单细胞原核生物（基因组大小一般小于10Mb），它包括真细菌和古生菌两大类群，根据其基本形态可分为球菌，杆菌，螺旋菌，根据细胞壁组成成分，又分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，大多数化脓性细菌属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病；而大多数肠道菌则属于革兰氏阴性菌，它们能产生内毒素使人致病。常见的革兰氏阳性菌有葡萄球菌，链球菌，肺炎双球菌，破伤风杆菌等；常见的革兰氏阴性菌有痢疾杆菌，伤寒杆菌，大肠杆菌，变形杆菌等。细菌对人类既有用处又有危害，一方面细菌是某些疾病的病原体，可导致伤寒、肺炎等疾病，另一方面，人类也常利用细菌制作乳酪及酸奶等。真菌则是一种低等真核生物（基因组大小约为2.5 Mb-100Mb），复杂度介于细菌和动植物之间，最常见的真菌是各类蕈类，霉菌和酵母。真菌门可分为担子菌亚门，子囊菌亚门，半知菌亚门等，其中担子菌亚门包含许多具有食用和药用价值的有益真菌，如银耳、金针菇、灵芝等，半知菌亚门则包含许多对农作物和森林致病的病原菌，如稻瘟病菌。
       随着高通量测序技术的迅速发展，测序成本大幅降低使得获得具有简单基因组的细菌/真菌基因组信息更加便捷，获得某个细菌/真菌基因组信息，不但可以帮助了解其表型特征，致病机制以及其重要相关基因的功能，还可以通过和其它细菌/真菌基因组信息进行比对分析和进化分析，从而了解其分子进化机制。根据不同的研究目的和需求，细菌/真菌基因组测序又包括细菌/真菌de novo测序（框架图、精细图、完成图）和细菌/真菌重测序，进一步可以细分为如下5个产品：
       细菌/真菌框架图：采用小片段建库，HiSeq深度测序和初步的基因组组装策略，性价比高，满足细菌/真菌基因组研究基本需求。
       细菌/真菌精细图：采用大片段加小片段建库，二代加三代测序和反复优化的基因组联合组装策略，是目前研究细菌/真菌基因组的主流技术。
       细菌完成图：综合利用一代二代甚至三代测序技术，根据菌株具体情况制定最优策略，最终得到一条完整的基因组序列（1 Contig，0 gaps），是细菌基因组测序组装的最高要求。
       真菌完成图：综合利用二代、三代测序技术，以及光学图谱 (OM) 技术，根据菌株具体情况制定最优策略，最终得到真菌的完成图 (scaffold_num = chr_num)，是真菌基因组测序组装的最新要求。
       细菌/真菌重测序：针对已知基因组序列的细菌/真菌，采用小片段建库，HiSeq深度测序，后续分析不依赖于组装，关注基因组变异情况（包括SNP和InDel等），是群体研究的首选。

2. 技术优势

A. 测序方案灵活：根据待测菌株定制最优策略，综合利用一代二代三代测序技术
B. 分析团队强大：拥有强大的生物信息团队，分析内容全面，并提供个性化分析
C. 实验体系严格：从DNA抽提，质检到文库构建，上机测序有严格的实验流程

3. 技术参数

4. 服务流程

A. 建库测序流程

B. 数据分析流程

5. 经典文章解读

案例1：肠球菌Enterococcus faecium TX16的全基因组测序及比较分析

背景：在欧美国家，肠球菌是医院获得性感染（hospital-acquired infections）的主要原因，其中Enterococcus faecalis和 Enterococcus faecium是导致肠球菌感染的两种最常见菌株。过去十年中，由E. faecium菌株引起肠球菌感染的比例不断上升。虽然在医院环境中E. faecium逐渐取代E. faecalis的机制并不清楚，但许多基因型鉴定和系统生物学研究已经指出了多种E. faecium菌株在全球临床环境中的广泛传播。然而，E. faecium完整基因组的缺失成为系统研究E. faecium分子流行病学和发病机制的主要障碍。

方法：在本研究中，首次对E. faecium菌株TX16（隶属于ST18家族）进行了全基因组测序。随后将TX16的全基因组与21个E. faecium菌株基因组草图（未完全测通）进行了比对，通过系统生物学，多位点序列分析和基因相似性分析，并对ORFs、多种基因和信号通路进行了分析。

结果：

1) 获得了E. faecium菌株TX16 的全基因组图谱，TX16基因组包含2,703个编码蛋白的ORFs、62个tRNA、6拷贝的核糖体rRNA 和32个非编码RNA。
2) 通过系统生物学，多位点序列分析和基因相似性分析，找到了医院相关菌株（HA）（hospital-associated strains，包含STs16、STs17、STs18、STs78家族），成功将HA菌株与非医院来源的CA菌株（community-associated）区分开来，HA菌株和CA菌株的核心基因组平均有3-4%的核苷酸序列差异。
3) 菌株TX16的378个ORFs在HA菌株中特异存在。大部份是转座子相关基因、转运蛋白基因、噬菌体基因。
4) TX16基因组中找到9个与致病性相关的基因组岛（GIs）。
5) 耐抗生素基因在HA菌株中大量富集。
6) 移动因子（如IS16和转座子）也几乎是HA菌株独有的。

图1：肠球菌Enterococcus faecium TX16的全基因组圈图。TX16基因组含有2,698,137 bp，包含2,703个编码蛋白的ORFs、62个tRNA、6拷贝的核糖体rRNA 和32个非编码RNA。

图2：22个E. faecium菌株的直接同源基因分析。分析发现2,543个基因只在某一个菌株中存在，22个菌株共有1,652个基因（1,608个单拷贝，44个多拷贝）。

图3：22个E. faecium菌株的核心基因和全部基因数量。 (A) E. faecium核心基因数量，最后汇聚到1,726个基因；(B) E. faecium全部基因数量，共包含6,262个基因。

图4：22个E. faecium菌株的进化树。成功的将HA菌株与CA菌株区分开来。

图5：22个E. faecium菌株基因组ORFs的比较。

参考文献：Xiang Qin, et al. Complete genome sequence of Enterococcus faecium strain TX16 and comparative genomic analysis of Enterococcus faecium genomes. BMC Microbiology 2012, 12:135.

案例2：全基因组重测序揭示肌球蛋白-5的突变引起禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗性

背景：小麦赤霉病是由禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）引起的一种重要病害，该病给小麦的产量造成严重损失。氰烯菌酯是一种新型杀菌剂，它能强烈抑制禾谷镰孢菌，但禾谷镰孢菌在选择压下易对氰烯菌酯产生抗性。因此了解禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗性机制就变得很重要，这将有助于对小麦赤霉病进行有效控制。

方法：为了探明禾谷镰孢菌对杀菌剂氰烯菌酯产生抗性的机制，以禾谷镰刀菌标准株PH-1作为参考，对抗氰烯菌酯菌株YP-1进行重测序（115×，99.35% coverage)，通过和PH-1序列进行比对，发现抗氰烯菌酯菌株YP-1的突变基因，然后针对这些突变基因在更多的抗性菌株中进行目标测序，从而确定影响氰烯菌酯抗性的位点，接着通过抗性实验确定导致对氰烯菌酯产生抗性的具体功能位点。

结果：

1) 通过和标准株PH-1序列进行比对，发现含有1989个SNP的抗氰烯菌酯菌株YP-1在132个基因上有氨基酸突变。
2) 在这132个发生氨基酸突变的基因中只有22个基因是在禾谷镰孢菌数据库中已知的。然后对氰烯菌酯敏感菌株2021和6个抗性菌株YP-1、Y2021A、B、C、D和F的这22个基因进行测序，结果只有肌球蛋白-5在所有抗性菌株中有点突变（肌球蛋白-5基因序列的216、217、418、420和786位点核苷酸发生改变）。
3) 为了证实肌球蛋白-5基因点突变是否真的引起对氰烯菌酯抗性，在抗性菌株YP-1，氰烯菌酯敏感菌株2021通过同源双交换技术交换肌球蛋白-5基因，结果发现导入一个拷贝抗性片段就能引起对氰烯菌酯抗性，导入一个拷贝感性片段就能引起对氰烯菌酯感性。
4) 氰烯菌酯抗性实验证明216、217、418和420位点突变能导致禾谷镰孢菌对氰烯菌酯产生抗性，而786位点突变则不能导致禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗性。

表1:禾谷镰刀菌抗氰烯菌酯菌株YP-1的全基因组测序数据统计（通过和标准株PH-1序列进行比对）

表2:在野生型2021和相关突变体中肌球蛋白-5核苷酸序列的改变（216、217、418、420和786位点核苷酸发生改变）

图1.氰烯菌酯抗性菌株在肌球蛋白-5基因216、217、418、420和786位点发生突变

图2. 通过同源双交换技术构建肌球蛋白-5基因重组突变体并进行验证

图3 . 禾谷镰刀菌株的菌落形态。(A) 氰烯菌酯（JS399-19）对敏感菌株（2021），抗性菌株（Y2021A、B、C、D和F），以及肌球蛋白-5基因点突变菌株生长的影响。(B) 2021，PH-1 和所有突变体的菌落形态。

参考文献： Zheng ZT, et al. Whole-genome sequencing reveals that mutationsinmyosin-5 confer resistanceto the fungicide phenamacril in Fusarium graminearum. Scientific Reports 2015, 5: 8248.